SYBR Green‐based real‐time PCR test for the identification of adults and larvae of the Japanese beetle Popillia japonica Newman (Coleoptera Scarabaeidae). (15th April 2022)

• Record Type: Journal Article
• Authors: Rizzo, Domenico; Da Lio, Daniele; Bruscoli, Tommaso; Cappellini, Giovanni; Bartolini, Linda; Salemi, Chiara; Aronadio, Antonio; Del Nista, Dalia; Oliver, Jason B.; Rossi, Elisabetta
• Is Part Of: Bulletin OEPP. Volume 52:Number 1(2022)
• Page Start: 141
• Page End: 148
• Publication Date: 2022-04-15
• Subjects: invasive pest molecular diagnostics -- molecular identification -- phytosanitary surveys -- SYBR Green real‐time PCR; Plant diseases -- Periodicals; Plants, Protection of -- Periodicals
• DOI: 10.1111/epp.12839
• Languages: English
• ISSNs: 0250-8052

Abstract

Abstract: The Japanese beetle ( Popillia japonica Newman) (Coleoptera Scarabaeidae) is a polyphagous invasive pest included in quarantine lists in Europe and in many countries of Africa, Asia and America. No specific molecular methods were available for the identification of adults and preimaginal stages. To bridge this gap, a rapid method (<2 h) based on SYBR Green real‐time PCR for identifying larvae and adults of P. japonica was developed in this study. SYBR Green chemistry was chosen for its cost‐effectiveness and adaptability although it has a lower specificity than other real‐time PCR tests such as the as TaqMan test which requires a probe design. The in‐silico primer specificity was tested, and the theoretical amplicon did not match any of the sequences deposited in databanks. The diagnostic specificity (exclusivity) of the test was assessed by testing the method on taxonomically related species ( Popillia anomaloides Kraatz, P. hilaris Kraatz and P. fallaciosa Fairmaire), other Coleoptera and unrelated insect species, with no cross‐reactions. Performance characteristics of the test, in terms of diagnostic specificity (inclusivity), analytical sensitivity, and accuracy, were evaluated. The analytical sensitivity determined on a single larva showed a LoD value of 3.20 pg/µL. The molecular test developed could be highly beneficial for the phytosanitary controls at entry points for the regulatory confirmation of specimen identity and/or for monitoring the presence and spread of P. japonica in the field. Identification d'adultes et de larves du scarabée japonais Popillia japonica Newman (Coleoptera Scarabaeidae) par test PCR en temps réel utilisant le colorant SYBR Green: Le scarabée japonais (Popillia japonica Newman) (Coleoptera Scarabaeidae) est un organisme nuisible polyphage envahissant qui figure actuellement sur les listes de quarantaine en Europe et dans de nombreux pays d'Afrique, d'Asie et d'Amérique. Aucune méthode moléculaire spécifique n'existait pour l'identification des adultes et des stades préimaginaux. Pour remédier à cela, une méthode rapide (en moins de 2 heures) basée sur les tests PCR en temps réel SYBR Green a été développée dans cette étude afin de permettre l'identification de larves et d'adultes de P. japonica. La chimie SYBR Green a été choisie pour sa rentabilité et son adaptabilité, bien qu'elle ait une spécificité inférieure à celle d'autres tests de PCR en temps réel, comme le test TaqMan, qui nécessite la conception d'une sonde. La spécificité de l'amorce a été testée in‐silico, et l'amplicon théorique ne correspondait à aucune des séquences déposées dans les banques de données. La spécificité diagnostique (exclusivité) du test a été évaluée en l'appliquant sur des espèces taxonomiquement apparentées ( Popillia anomaloides Kraatz, P. hilaris Kraatz et P. fallaciosa Fairmaire), ainsi que sur d'autres coléoptères et des espèces d'insectes non apparentées : aucune réaction croisée n'a été observée. Les caractéristiques de performance du test, en termes de spécificité diagnostique (inclusivité), de sensibilité analytique et de précision, ont été évaluées. La sensibilité analytique déterminée sur une seule larve présentait une valeur de LoD de 3, 20 pg/µL. Ce test moléculaire pourrait s'avérer très utile pour les contrôles phytosanitaires aux points d'entrée, pour faciliter la confirmation réglementaire de l'identité des spécimens et/ou pour le suivi de la présence et de la dissémination de P. japonica sur le terrain. Тест ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green для идентификации взрослых особей и личинок японского жука Popillia japonica Newman (Coleoptera Scarabaeidae): Японский жук ( Popillia japonica Newman) (Coleoptera Scarabaeidae) является многоядным инвазивным вредным организмом, включенным в карантинные перечни в Европе и во многих странах Африки, Азии и Америки. Для идентификации взрослых особей и преимагинальных стадий развития не было разработано специальных молекулярных методов. Чтобы восполнить этот пробел, в нашем исследовании был разработан быстрый метод (2 часа) на основе SYBR Green ПЦР в реальном времени для идентификации личинок и взрослых особей P. japonica. Химический метод SYBR Green был избранный из‐за его экономичности и адаптивности, хотя он имеет более низкую специфичность, чем другие тесты ПЦР в реальном времени, такие как тест TaqMan, который требует разработки зонда. Была проверена специфичность праймеров in‐silico, и теоретический ампликон не совпал ни с одной из последовательностей, представленных в банке данных. Диагностическая специфичность (исключительность) теста была оценена путем тестирования метода на таксономически родственных видах ( Popillia anomaloides Kraatz, P. hilaris Kraatz и P. fallaciosa Fairmaire), на других жесткокрылых и совершенно не родственных видах насекомых, при этом перекрестных реакций не было. Были оценены характеристики производительности теста с точки зрения диагностической специфичности (инклюзивности), аналитической чувствительности и точности. Аналитическая чувствительность, определенная на одной личинке, показала значение LoD 3, 20 пг/мкл. Разработанный молекулярный тест может быть очень полезен для фитосанитарных проверок в пунктах ввоза для нормативного подтверждения идентичности образцов и/или для мониторинга присутствия и распространения P. japonica в полевых условиях.