Characterization of canine epidermal organoid cultures by immunohistochemical analysis and quantitative PCR. Issue 2 (9th November 2020)

• Record Type: Journal Article
• Authors: Wiener, Dominique J.; Studer, Isabelle C.; Brunner, Magdalena A.T.; Hermann, Andreas; Vincenti, Simona; Zhang, Meng; Groch, Kátia R.; Welle, Monika M.
• Is Part Of: Veterinary dermatology. Volume 32:Issue 2(2021)
• Page Start: 179
• Page End: e44
• Publication Date: 2020-11-09
• Subjects: Veterinary dermatology -- Periodicals; Pet medicine -- Periodicals; 636.08965
• DOI: 10.1111/vde.12914
• Languages: English
• ISSNs: 0959-4493

Abstract

Abstract : Background: Keratinocyte organoids can be used as a tool to evaluate epidermal structure, function and dysfunction. Objectives: To optimize the canine keratinocyte organoid system and produce organoids that are structurally equivalent to in vivo canine epidermis, in order to enable studies that focus on epidermal diseases and diseases resulting from an impaired epidermal barrier. Animals: Skin biopsies were obtained from five recently euthanized dogs of different breeds with no skin abnormalities. Methods and materials: Cells derived from microdissected interfollicular epidermis were seeded in basement membrane extract and epidermal organoids were grown under different media conditions. Organoids were characterized to assess cell morphology and architecture in haematoxylin and eosin‐stained slides and expression of selected epidermal markers (keratin 5, keratin 10, loricrin and filaggrin) by immunohistochemical analysis and quantitative reverse transcription PCR. Results: The selected epidermal markers were expressed in the same epidermal layers in the organoids cultured in expansion medium and differentiation medium as in normal interfollicular epidermis, yet restriction to the distinct layers was best achieved with expansion medium. Comparison of the mRNA expression levels of these markers revealed that relative expression is similar in organoids cultured in expansion medium and normal canine epidermis, while it differs in organoids cultured in differentiation medium. Conclusion and clinical importance: Organoids cultured in expansion medium have an equivalent structure to the interfollicular epidermis and express key marker proteins in similar proportions. Epidermal organoids are therefore a promising in vitro model to study epidermal structure, function and dysfunction. Abstract : Background – Keratinocyte organoids can be used as a tool to evaluate epidermal structure, function and dysfunction. Objectives – To optimize the canine keratinocyte organoid system and produce organoids that are structurally equivalent to in vivo canine epidermis, in order to enable studies that focus on epidermal diseases and diseases resulting from an impaired epidermal barrier. Conclusion and clinical importance – Organoids cultured in expansion medium have an equivalent structure to the interfollicular epidermis and express key marker proteins in similar proportions. Epidermal organoids are therefore a promising in vitro model to study epidermal structure, function and dysfunction. Résumé: Contexte: Les organoïdes kératinocytaires peuvent être utilisés pour évaluer la structure, les fonctions et dysfonctions épidermiques. Objectifs: Optimiser les organoïdes kératinocytaires canins et produire des organoïdes qui sont structurellement équivalents à l'épiderme canin épidermique in vivo, afin de permettre aux études de se focaliser sur les maladies de l'épiderme et les maladies résultant d'un défaut de barrière épidermique. Sujets: Les biopsies cutanées ont été obtenues de cinq chiens récemment euthanasiés de différentes races sans anomalies cutanées. Méthodes: Les cellules dérivées d'épiderme inter folliculaire micro disséqué ont été mises en culture sur des extraits de membrane basale et les organoïdes épidermiques ont été mis en culture sous différentes conditions. Les organoïdes ont été caractérisés pour déterminer la morphologie cellulaire et l'architecture sur des coupes colorées à l'hémalun‐éosine et l'expression de plusieurs marqueurs épidermiques sélectionnés (kératine 5, kératine 10, loricrine et filaggrine) par analyse immunohistochimique et PCR transcription reverse quantitative. Résultats: Les marqueurs épidermiques sélectionnés ont été exprimés dans les mêmes couches épidermiques dans les organoïdes cultivés en milieu d'expansion et milieu de différenciation que dans un épiderme inter folliculaire normal, alors que les restrictions aux différentes couches étaient mieux atteintes avec le milieu d'expansion. La comparaison des niveaux d'expression d'ARNm de ces marqueurs révèle que l'expression relative est identique dans les organoïdes cultivés dans le milieu d'expansion et l'épiderme canin normal, alors qu'il diffère dans les organoïdes cultivés dans le milieu de différenciation. Conclusion et importance clinique: Les organoïdes cultivés dans le milieu d'expansion ont une structure équivalente à l'épiderme inter folliculaire et expriment des protéines marquées clés dans les proportions identiques. Les organoïdes épidermiques sont ainsi un modèle in vitro prometteur pour l'étude de la structure, la fonction et dysfonction épidermique. Sources de financement: Ce travail a été soutenu par l'ESVD (European Society of Veterinary Dermatology‐Major Research Grant) et la Société Internationale de Dermatopathologie Vétérinaire (ISVD Research Grant). Resumen: Introducción: los organoides de queratinocitos se pueden utilizar como una herramienta para evaluar la estructura, función y disfunción epidérmica. Objetivos: Optimizar el sistema organoide de queratinocitos caninos y producir organoides que sean estructuralmente equivalentes a la epidermis canina in vivo, para permitir estudios que se centren en enfermedades epidérmicas y enfermedades resultantes de una barrera epidérmica deteriorada. Animales: se obtuvieron biopsias de piel de cinco perros recientemente sacrificados de diferentes razas sin anomalías en la piel. Métodos: Se sembraron células derivadas de epidermis interfolicular microdiseccionada en extracto de membrana basal y se cultivaron organoides epidérmicos en diferentes condiciones de medio. Los organoides se caracterizaron para evaluar la morfología y la arquitectura celular en portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina y se evaluó la expresión de marcadores epidérmicos seleccionados (queratina 5, queratina 10, loricrina y filagrina) mediante análisis inmunohistoquímico y PCR cuantitativa de transcripción inversa. Resultados: los marcadores epidérmicos seleccionados se expresaron en las mismas capas epidérmicas en los organoides cultivados en medio de expansión y medio de diferenciación que en la epidermis interfolicular normal, pero la restricción a las distintas capas se logró mejor con medio de expansión. La comparación de los niveles de expresión de RNAm de estos marcadores reveló que la expresión relativa es similar en los organoides cultivados en medio de expansión y la epidermis canina normal, mientras que difiere en los organoides cultivados en medio de diferenciación. Conclusión e importancia clínica: los organoides cultivados en medio de expansión tienen una estructura equivalente a la epidermis interfolicular y expresan proteínas marcadoras clave en proporciones similares. Los organoides epidérmicos son, por tanto, un modelo in vitro prometedor para estudiar la estructura, función y disfunción epidérmica. Fuentes de financiación: este trabajo ha sido financiado por la Sociedad Europea de Dermatología Veterinaria (Beca de Investigación Principal ESVD) y la Sociedad Internacional de Dermatopatología Veterinaria (Beca de Investigación ISVD). Zusammenfassung: Hintergrund: Keratinozyten Organoide können als Werkzeug zur Evaluierung epidermaler Strukturen, sowie ihrer Funktion und Dysfunktion angewendet werden. Ziele: Eine Optimierung des Keratinozyten Organoid Systems des Hundes und eine Produktion von Organoiden, die strukturell mit der caninen Epidermis in vivo equivalent sind, um Studien zu ermöglichen, die sich auf epidermale Strukturen konzentrieren, sowie auf Erkrankungen, die durch eine fehlerhafte epidermale Barriere entstehen. Tiere: Es wurden Hautbiopsien von fünf unlängst euthanasierten Hunden verschiedener Rassen ohne Abnormalitäten der Haut genommen. Methoden: Durch Mikrodissektion gewonnene Zellen der interfollikulären Epidermis wurden in Basalmembranextrakt ausgesät und epidermale Organoide unter verschiedenen Medien angezüchtet. Die Organoide wurden gekennzeichnet, um die Zellmorphologie und ihre Architektur auf Hämatoxylin‐Eosin gefärbten Objektträgern zu beschreiben und die Exprimierung von ausgewählten epidermalen Markern (Keratin 5, Keratin 10, Lorikrin und Filaggrin) mittels immunhistochemischer Analyse und quantitativer Reverse Transkriptase PCR festzustellen. Ergebnisse: Die ausgewählten Epidermis Marker wurden in den in Expansionsmedium sowie in Differenzialnährmedium kultivierten Organoiden in denselben epidermalen Schichten wie in der normalen interfollikulären Epidermis exprimiert, allerdings wurde eine Beschränkung auf die individuellen Schichten am besten mittels Expansionsmedium erzielt. Ein Vergleich der Exprimierungslevels der mRNA dieser Marker zeigte, dass eine relative Exprimierung in den organoiden Kulturen in Expansionsmedium und in normaler caniner Epidermis ähnlich ist, während es in Organoiden, die in Differenzialnährmedium kultiviert worden waren, anders ist. Schlussfolgerung und klinische Bedeutung: Organoide, die in Expansionsmedium kultiviert wurden, haben eine äquivalente Struktur wie die interfollikuläre Epidermis und exprimieren Schlüsselmarkerproteine in ähnlichen Proportionen. Epidermale Organoide sind daher ein vielversprechendes in vitro Modell, um epidermale Strukturen, ihre Funktion und Dysfunktion zu untersuchen. Quellen der Finanzierung: Diese Arbeit wurde von der European Society of Veterinary Dermatology (ESVD Major Research Grant) und der International Society of Veterinary Dermatopathology (ISVD Research Grant) unterstützt. 要約: 背景: ケラチノサイトオルガノイドは、表皮の構造、機能および機能障害を評価するツールとして使用することができる。 目的: 本研究の目的は、犬のケラチノサイトオルガノイドシステムを最適化し、 in vivo の犬表皮と構造的に同等のオルガノイドを生成し、表皮疾患および表皮バリア障害に起因する疾患に焦点を当てた研究を可能にすることであった。 供試動物: 皮膚生検は、皮膚の異常がなく、最近安楽死された、異なる犬種5頭から得られた。 方法: 顕微解剖された毛包間表皮由来細胞を基底膜抽出物に播種し、表皮オルガノイドをさまざまな培地条件下で増殖させた。オルガノイドを、免疫組織化学的解析および定量逆転写PCR法によって、ヘマトキシリン・エオジン染色スライドの細胞形態と構造、および選択した表皮マーカー (ケラチン5、ケラチン10、ロリクリン、フィラグリン) の発現を評価することで特徴付けた。 結果: 選択した表皮マーカーは、通常の毛包間表皮と同じように、増殖培地および分化培地で培養したオルガノイドの同じ表皮層で発現したが、異なる層への制限は増殖培地で最もよく達成された。これらのマーカーのmRNA発現レベルの比較により、相対的発現は、増殖培地で培養されたオルガノイドと正常な犬表皮で類似しているが、分化培地で培養されたオルガノイドでは異なることが明らかになった。 結論と臨床的重要性: 増殖培地で培養されたオルガノイドは、毛包間表皮と同等の構造を持ち、同様の比率で重要なマーカータンパク質を発現する。したがって、表皮オルガノイドは、表皮の構造、機能および機能障害を研究する有望な in vitro モデルである。 資金源: 本研究は、欧州獣医皮膚科学会 (ESVD主要研究助成金) および国際獣医皮膚病理学会 (ISVD研究助成金) によって支援されている。 摘要: 背景: 角质细胞类器官可用作评价表皮结构、功能和功能障碍的工具。 目的: 优化犬角质细胞类器官系统, 并产生结构与体内犬表皮相当的类器官, 以便能够对表皮疾病和表皮屏障受损导致的疾病进行研究。 动物: 从5只近期安乐死的不同品种犬中获得皮肤活检标本, 无皮肤异常。 方法: 将显微切割的毛囊间表皮细胞接种于基底膜提取物中, 在不同培养基条件下生长表皮类器官。对类器官进行表征, 以评估苏木精和伊红染色切片中的细胞形态和结构, 并通过免疫组织化学分析和定量逆转录PCR评估选定表皮标记物 (角质5、角质10、氯菊酯和丝聚蛋白) 的表达。 结果: 在扩增培养基和分化培养基中培养的类器官中, 选择的表皮标记物表达于与正常毛囊间表皮相同的表皮层, 然而用扩增培养基能最好地实现对不同层的限制。比较这些标记物的mRNA表达水平发现, 在扩增培养基和正常犬表皮中培养的类器官中相对表达量相似, 而在分化培养基中培养的类器官中相对表达量不同。 结论和临床重要性: 在扩增培养基中培养的类器官具有与毛囊间表皮相当的结构, 并以相似的比例表达关键标记蛋白。因此表皮类器官是研究表皮结构、功能和功能障碍的一种有前景的体外模型。 资金来源: 本研究得到了欧洲兽医皮肤病学会 (ESVD主要研究基金) 和国际兽医皮肤病病理学学会 (ISVD研究基金) 的支持。 Resumo: Contexto: Organoides de queratinócitos podem ser utilizados ​​como uma ferramenta para avaliar a estrutura, função e disfunção da epiderme. Objetivos: Otimizar o sistema de organoides de queratinócitos caninos e produzir organoides estruturalmente equivalentes à epiderme canina in vivo, a fim de se possibilitar estudos que focados em doenças epidérmicas e doenças decorrentes do comprometimento da barreira epidérmica. Animais: As biópsias de pele foram obtidas de cinco cães eutanasiados recentemente, de diferentes raças, sem alterações cutâneas. Métodos: Células oriundas de epiderme interfolicular microdissecada foram semeadas em extrato de membrana basal e os organoides epidérmicos foram cultivados em diferentes meios de cultura. Os organoides foram avaliados para caracterizar a morfologia e arquitetura celular em lâminas coradas com hematoxilina e eosina e expressão de marcadores epidérmicos selecionados (queratina 5, queratina 10, loricrina e filagrina) por análise imunohistoquímica e PCR de transcrição reversa quantitativa. Resultados: Os marcadores epidérmicos selecionados foram expressos nas mesmas camadas epidérmicas nos organoides cultivados em meio de expansão e meio de diferenciação como na epiderme interfolicular normal, mas a restrição às camadas distintas foi melhor alcançada com meio de expansão. A comparação dos níveis de expressão de mRNA desses marcadores revelou que a expressão relativa é semelhante em organoides cultivados em meio de expansão e epiderme canina normal, enquanto difere em organoides cultivados em meio de diferenciação. Conclusões e importância clínica: Os organoides cultivados em meio de expansão têm uma estrutura equivalente à epiderme interfolicular e expressam proteínas marcadoras‐chave em proporções semelhantes. Os organoides epidérmicos são, portanto, um modelo in vitro promissor para estudar a estrutura, função e disfunção epidérmica. Fontes de financiamento: Este trabalho foi financiado pela Sociedade Europeia de Dermatologia Veterinária (ESVD Major Research Grant) e pela International Society of Veterinary Dermatopathology (ISVD Research Grant)