Lokale Deuterierung ermöglicht NMR‐Messung von Methylgruppen in Proteinen aus eukaryotischen und Zell‐freien Expressionssystemen. (6th May 2021) - Dubey, Abhinav
Abstract: GPCRs, Antikörper, Proteinkinasen und andere therapeutisch relevante Proteine stellen NMR‐Untersuchungen vor klare Herausforderungen, da die notwendige ortspezifische Isotopenmarkierung sowie Deuterierung in eukaryotischen Expressionsystemen stark limitiert ist. Wir beschreiben hier eine kostengünstige und einfache Methode, mit der Proteine mit markierten Leucin‐Methylgruppen in bakteriellen, eukaryotischen oder zell‐freien Expressionssystemen hergestellt werden können, ohne dass bestehende Expressionsprotokolle abgeändert werden müssen. Dafür werden Leucine stereo‐selektiv 13 C‐markiert und deuteriert, was den Bedarf für eine Deuterierung des Restproteins abmildert. Die resultierenden verbesserten NMR‐spektroskopischen Eigenschaften werden detailliert mittels Forbidden Coherence Transfer (FTC)‐Experimenten und Simulationen beschrieben. Die Anwendung dieser Isotopenmarkierung wird anhand von zell‐freier Synthese von Bakteriorhodopsin und der Expression der RRM2‐Domäne von humanem RBM39 in Insektenzellen gezeigt. Abstract : Die Nutzung der Methyl‐Magnetisierung kann Untersuchungen großer Proteinsysteme mittels NMR‐Spektroskopie stark begünstigen. Hier wird eine einfache und kostengünstige Methode vorgestellt, um lokal deuteriertes Leucin zu erhalten, das für Methyl‐NMR geeignet ist. Der Ansatz erweitert die Anwendbarkeit der Methylmarkierung in neuen Expressionssystemen erheblich, einschließlich zellfreier und eukaryotischer Systeme.