Diagnostic performance of a qPCR for Leishmania on stained cytological specimens and on filter paper impressions obtained from cutaneous lesions suggestive of canine leishmaniosis. Issue 4 (28th May 2019)

• Record Type: Journal Article
• Authors: Lima, Tatiana; Martínez‐Sogues, Laura; Montserrat‐Sangrà, Sara; Solano‐Gallego, Laia; Ordeix, Laura
• Is Part Of: Veterinary dermatology. Volume 30:Issue 4(2019)
• Page Start: 318
• Page End: e89
• Publication Date: 2019-05-28
• Subjects: Veterinary dermatology -- Periodicals; Pet medicine -- Periodicals; 636.08965
• DOI: 10.1111/vde.12757
• Languages: English
• ISSNs: 0959-4493

Abstract

Abstract : Background: Detection of Leishmania in cutaneous lesions is possible by visualization of amastigotes. Detection of Leishmania DNA by PCR presents greater sensitivity, and PCR has been used to diagnose cutaneous leishmaniosis in humans using noninvasive clinical specimens. Objectives: Study I: to determine if Leishmania DNA could be efficiently extracted and amplified from archived Diff‐Quik ® ‐stained slides of cytological specimens from canine cutaneous lesions. Study II: to evaluate the diagnostic performance of a Leishmania‐ quantitative (q)PCR on stained cytological specimens and on filter paper impressions (FPI) obtained from cutaneous lesions suggestive of canine leishmaniosis (CanL). Animals: Samples from cutaneous lesions of 54 dogs. Methods and materials: Study I: Leishmania ‐qPCR was performed on 19 glass slides (from nine dogs) with cytologically visible amastigotes. Fifteen slides with no visible amastigotes, obtained from 12 dogs seronegative for Leishmania by ELISA, served as controls. Study II: Leishmania ‐qPCR was performed on glass slides and FPI from cutaneous lesions compatible with clinical leishmaniosis in 33 dogs. Results: Study I: all slides with visible amastigotes had positive qPCR, whereas all control slides yielded negative results. Study II: of 13 dogs definitively diagnosed with clinical leishmaniosis, eight had visible amastigotes on cytology, whereas Leishmania ‐qPCR was positive on 11 glass slides and 13 FPI. Leishmaniosis was ruled out by standard methods in 20 dogs, four of which yielded positive qPCR on FPI and/or glass slides. Conclusions and clinical importance: Leishmania ‐DNA can be detected efficiently by qPCR from cutaneous cytological specimens and FPI to diagnose Leishmania infection in dogs with cutaneous lesions suggestive of CanL. Abstract : Background – Detection of Leishmania in cutaneous lesions is possible by visualization of amastigotes. Detection of Leishmania DNA by PCR presents greater sensitivity, and PCR has been used to diagnose cutaneous leishmaniosis in humans using noninvasive clinical specimens.Objectives – Study I: to determine if Leishmania DNA could be efficiently extracted and amplified from archived Diff‐Quik ® ‐stained slides of cytological specimens from canine cutaneous lesions. Study II: to evaluate the diagnostic performance of a Leishmania‐ quantitative (q)PCR on stained cytological specimens and on filter paper impressions (FPI) obtained from cutaneous lesions suggestive of canine leishmaniosis (CanL).Conclusions and clinical importance – Leishmania ‐DNA can be efficiently detected by qPCR from cutaneous cytological specimens and FPI to diagnose Leishmania infection in dogs with cutaneous lesions suggestive of CanL. Résumé: Contexte: Détection de Leishmania dans les lésions cutanées est possible par visualisation des amastigotes. La détection de l'ADN de Leishmania par PCR présente une meilleure sensibilité et la PCR a été utilisée pour diagnostiquer la leishmaniose cutanée de l'homme à l'aide de techniques cliniques non invasives. Objectifs: Etude I : déterminer si l'ADN de Leishmania peut être efficacement extraite et amplifiée de lames colorées au Diff‐Quik ® de prélèvements cytologiques de lésions cutanées canines. Etude II : évaluer la performance de diagnostic de PCR quantitative (qPCR) de Leishmania sur des cytologies et sur des calques sur papier filtre (FPI) obtenues sur des léisons cutanées suggestives de leishmaniose canine (CanL). Sujets: Echantillons de lésions cutanées de 54 chiens. Matériel et méthode: Etude I : la PCRq a été réalisée sur 19 lames (de 9 chiens) avec des amastigotes visibles à la cytologie. Quinze lames sans amastigote visible, obtenu de 12 chiens séronégatifs pour Leishmania par ELISA, ont servi de contrôle. Etude II : Une PCRq Leishmania a été réalisée sur des lames et FPI de lésions cutanées compatibles avec une leishmaniose clinique chez 33 chiens. Résultats: Etude I : toutes les lames avec amastigotes visibles avaient une PCRq positive tandis que les lames contrôles étaient négatives. Etude II : sur les 13 chiens diagnostiqués définitivement comme leishmaniose clinique, huit avaient des amastigotes visibles à la cytologie tandis que la PCRq Leishmania était positive sur 11 des lames et 13 FPI. LA leishmaniose a été exclue par méthodes standard chez 20 chiens, dont quatre présentaient une PCRq positive sur FPI et/ou lames. Conclusions et importance clinique: L'ADN de Leishmania peut être détectée efficacement par PCRq de cytologies cutanées et FPI pour le diagnostic de leishmaniose chez les chiens présentant des lésions cutanées évocatrices de CanL. Resumen: Introducción: la visualización de amastigotes permite la detección de Leishmania en lesiones cutáneas. La detección del DNA de Leishmania por PCR es más sensible, y la PCR se ha utilizado para diagnosticar la leishmaniasis cutánea en humanos utilizando muestras clínicas no invasivas. Objetivos: Estudio I: determinar si el DNA de Leishmania se podría extraer y amplificar de manera eficiente a partir de preparaciones teñidas con Diff‐Quik® archivadas de muestras citológicas de lesiones cutáneas caninas. Estudio II: evaluar el valor diagnóstico de una PCR cuantitativa (qPCR) de Leishmania en muestras citológicas teñidas y en impresiones de papel de filtro (FPI) obtenidas de lesiones cutáneas sugestivas de leishmaniasis canina (CanL). Animales: muestras de lesiones cutáneas de 54 perros. Métodos y materiales: Estudio I: se realizó qPCR para Leishmania en 19 portaobjetos de vidrio (de nueve perros) con amastigotes citológicamente visibles. Quince preparaciones sin amastigotes visibles, obtenidas de 12 perros seronegativos para Leishmania por ELISA, sirvieron como controles. Estudio II: se realizó qPCR para Leishmania en portaobjetos de vidrio y FPI de lesiones cutáneas compatibles con leishmaniasis clínica en 33 perros. Resultados: Estudio I: todas las preparaciones con amastigotes visibles tuvieron qPCR positiva, mientras que todas las preparaciones de control dieron resultados negativos. Estudio II: de 13 perros diagnosticados definitivamente con leishmaniasis clínica, ocho tuvieron amastigotes visibles en la citología, mientras que qPCR para Leishmania fue positiva en 11 portaobjetos de vidrio y 13 FPI. La leishmaniasis se descartó mediante métodos estándar en 20 perros, cuatro de los cuales produjeron qPCR positiva en FPI y/o portaobjetos de vidrio. Conclusiones e importancia clínica: la qPCR para DNA de Leishmania puede realizarse de forma efectiva a partir de muestras citológicas cutáneas y FPI para diagnosticar la infección por Leishmania en perros con lesiones cutáneas sugestivas de CanL. Zusammenfassung: Hintergrund: Leishmanien können in Hautveränderungen durch eine Sichtbarmachung der Amastigoten gefunden werde. Die Feststellung von Leishmania DNA mittels PCR bedeutet eine größere Sensibilität. Außerdem wurde die PCR verwendet, um kutane Leishmaniose bei Menschen mittels nichtinvasiver klinischer Proben zu diagnostizieren. Ziele: Studie I: festzustellen, ob ausreichend Leishmania DNA aus archivierten Diff‐Quick® gefärbten zytologischen Präparaten aus kutanen Veränderungen extrahiert und amplifiziert werden konnte. Studie II: eine Evaluierung der diagnostischen Leistung einer quantitativen Leishmania (q) PCR aus gefärbten Zytologiepräparaten sowie aus Abdrücken auf Filterpapier (FPI), die aus Hautveränderungen stammten, die verdächtig für eine canine Leishmaniose (CanL) waren. Tiere: Es wurden Proben von Hautveränderungen von 54 Hunden verwendet. Methoden und Materialien: Studie I: Es wurde ein Leishmania ‐qPCR von 19 Objektträgern (von neun Hunden) mit zytologisch sichtbaren Amastigoten durchgeführt. Fünfzehn Objektträger ohne sichtbare Amastigoten, die von 12 Hunden stammten, die mittels ELISA seronegativ auf Leishmania waren, dienten als Kontrollen. Studie II: Ein Leishmania ‐qPCR wurde von Objektträgern und FPI kutaner Läsionen von 33 Hunden, die mit klinischer Leishmaniose kompatibel waren, durchgeführt. Ergebnisse: Studie I: alle Objektträger mit sichtbaren Amastigoten zeigten eine positive qPCR, während die Kontrollen ein negatives Ergebnis lieferten. Studie II: von den 13 Hunden, die definitiv mit einer Leishmaniose diagnostiziert worden waren, zeigten acht sichtbare Amastigoten in der Zytologie, während der Leishmania ‐PCR von 11 Objektträgern und 13 FPI positiv war. Eine Leishmaniose war bei 20 Hunden mit Standardmethoden ausgeschlossen worden, von denen vier eine positive qPCR von FPI und/oder Objektträgern lieferten. Schlussfolgerungen und klinische Bedeutung: Leishmania ‐DNA kann effektiv mittels qPCR aus kutanen zytologischen Hautproben und aus FPI festgestellt werden, um eine Leishmania Infektion bei Hunden mit Hautveränderungen, die auf CanL hinweisen zu diagnostizieren. 要約: 背景: 皮膚病変におけるリーシュマニアの検出は、無鞭毛期虫体の視覚化によって可能となる。 PCRによるリーシュマニアDNAの検出はより高い感度を示し、PCRは非侵襲性臨床標本を用いて人の皮膚リーシュマニア症を診断するために使用されてきた。 目的: 研究I:研究Iの目的は、犬の皮膚病変から得られた細胞学的標本のアーカイブされたDiff‐Quik®染色スライドからLeishmania DNAを効率的に抽出および増幅できるかどうかを決定することである。研究II:研究IIの目的は、染色した細胞学的標本および犬リーシュマニア症(CanL)を示唆する皮膚病変から得られたfilter paper impressions (FPI)に対するリーシュマニア定量的(q)PCRの診断性能を評価することである。 被験動物: 54頭の犬の皮膚病変からのサンプル。 材料と方法: 研究I:Leishmania‐qPCRを、細胞学的に観察可能な無鞭毛期虫体を含む19枚のスライドガラス(9頭の犬から)によって実施した。 ELISAによってリーシュマニアに対して血清陰性の12頭の犬から得られた、目に見える無鞭毛期虫体のない15枚のスライドを対照として用いた。研究II:33頭の犬において、リーシュマニアqPCRを、臨床的にリーシュマニア症と適合性のある皮膚病変からのスライドガラスおよびFPIに対して実施した。 結果: 研究I:目に見える無鞭毛期虫体を含む全てのスライドがqPCR陽性であったのに対し、全対照スライドは陰性結果をもたらした。研究II:臨床リーシュマニア症と確定診断された13頭の犬のうち、8頭が細胞診で目に見える斑点があったのに対し、Leishmania‐qPCRは11枚のスライドガラスと13枚のFPIで陽性を示した。リーシュマニア症は、20頭の犬において標準的な方法で除外され、そのうちの4頭はFPIおよび/またはスライドガラス上でqPCR陽性を示した。 結論と臨床的重要性: リーシュマニアDNAは、CanLを示唆する皮膚病変を有する犬におけるリーシュマニア感染を診断するために、皮膚細胞診標本およびFPIからqPCRによって効率的に検出することができる。 摘要: 背景: 通过发现无鞭毛体可以检测皮肤病变中的利什曼原虫。 PCR检测利什曼原虫DNA具有更高的灵敏度, 并且无创临床样本的PCR检测已被用于诊断人类皮肤利什曼病。 目的: 研究I:确认是否能从已被Diff‐Quik®染色的犬皮肤病变细胞学载玻片中, 有效提取和扩增利什曼原虫DNA。研究II:染色细胞学和滤纸印迹(FPI)均采自疑似犬利什曼病(CanL)的皮肤病变, 评估利什曼原虫定量(q)PCR方法对这些样本的诊断效果。 动物: 54只犬的皮肤病变样本。 方法和材料: 研究I:细胞学检查可见无鞭毛体的19张载玻片(来自9只犬), 对其进行利什曼原虫‐qPCR检测;从 12只犬身上获得的15张载玻片样本作为对照, 细胞学检查未见无鞭毛体, 经ELISA检测利什曼原虫血清阴性。研究II:33只症状符合利什曼病的犬, 用利什曼原虫‐qPCR法检测其皮肤病变载玻片和FPI。 结果: 研究I:所有可见无鞭毛体的载玻片, 其qPCR检测均为阳性, 而所有对照载玻片的检测结果均为阴性。 研究II: 13只确诊利什曼病的患犬中, 8只细胞学上可见无鞭毛体, 而利什曼原虫‐qPCR检测中11张载玻片和13份FPI呈阳性。用标准方法排除利什曼病的20只犬中, 经qPCR检测FPI和/或载玻片, 有4只呈阳性。 结论和临床价值: 用qPCR技术检测皮肤细胞学和FPI中的利什曼原虫DNA, 可有效诊断皮肤病变疑似CanL的利什曼原虫感染。 Resumo: Contexto: A detecção de Leishmania em lesões cutâneas é possível pela visualização de amastigotas. A detecção de DNA de Leishmania por PCR possui maior sensibilidade, e a PCR tem sido utilizada para diagnosticar leishmaniose cutânea em humanos utilizando espécimens clínicos não invasivos. Objetivos: Estudo I: determinar se o DNA de Leishmania pode ser eficientemente extraído e amplificado de lâminas coradas em Diff‐Quik ® arquivadas, oriundas de espécimens de lesões cutâneas caninas. Estudo II: avaliar o desempenho diagnóstico da PCR quantitativa para Leishmania ( Leishmania ‐qPCR) em espécimens citológicos corados e em impressões em papel filtro (FPI) obtidas de lesões cutâneas sugestivas de leishmaniose canina (CanL). Animais: Amostras cutâneas de lesões de 54 cães. Métodos e materiais: Estudo I: Leishmania ‐qPCR foi realizado em 19 lâminas de vidro (de nove cães) com amastigotas citologicamente visíveis. Quinze lâminas sem amastigotas visíveis, obtidas de 12 cães soronegativos para Leishmania por ELISA serviram como controle. Estudo II: Leishmania ‐qPCR foi realizado em lâminas de vidro e em FPI de lesões cutâneas compatíveis com leishmaniose clínica em 33 cães. Resultados: Estudo I: todas as amostras com amastigotas visíveis apresentaram qPCR positivo, enquanto todas as lâminas controle tiveram resultados negativos. Estudo II: dos 13 cães diagnosticados definitivamente com leishmaniose clínica, oito apresentaram amastigotas visíveis na citologia, enquanto Leishmania ‐qPCR foi positivo em 11 lâminas de vidro e 13 FPI. Descartou‐se a leishmaniose pelos métodos convencionais em 20 cães, dos quais quatro apresentaram qPCR positiva na FPI e/ou nas lâminas de vidro. Conclusões e importância clínica: O DNA de Leishmania pode ser eficientemente detectado por qPCR de espécimens citológicos cutâneos e FPI para diagnosticar uma infecção por Leishmania em cães com lesões cutâneas sugestivas de CanL.